产品货号：
BTN130301
中文名称：
DNA甲基化修饰试剂盒
英文名称：
Embedded Bisulfite Modification Kit
产品规格：
150次
发货周期：
1～3天
产品价格：
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DNA甲基化分析中的关键步骤是亚硫酸氢盐修饰DNA，此反应要求DNA必须处于单链状态，反应还必须在低温进行。由于常规的修饰反应都在液相进行，在低温下让液相中的DNA保持单链状态非常棘手，故修饰效率很低。此外，修饰反应要多次切换反应液，有多个沉淀步骤，故DNA回收率一般都不高于50%。为克服这些缺点，本公司开发出了此产品。
- 用包埋的DNA进行所有操作，免去所有沉淀和纯化步骤，极大简化了操作。
- 免去了DNA提取过程，所需实验材料更少，最少几个细胞都可以，极大地节约了宝贵材料，尤其适用于珍稀材料。
- 包埋中的DNA在整个操作过程中都处于单链状态，提高了修饰效率。
- DNA包埋在包埋块中，切换反应液不但非常方便，而且DNA回收率都在90%以上。
- 既适用于实体材料和悬浮细胞，也适用于纯化好的DNA样品。
| 组分 | 规格 |
| DNA甲基化修饰溶液A | 30mL |
| 包埋液 | 1.5mL |
| 包埋块裂解液 | 12.5mL |
| 分子生物学级石蜡油 | 25mL |
| 蛋白酶K溶液(10mg/mL) | 150μL |
| DNA甲基化修饰溶液B成分一 | 2.3g×5 |
| DNA甲基化修饰溶液B成分二 | 110mg×5 |
| TE缓冲液，pH8.0 | 125mL |
保存：-20℃，有效期1年。
本试剂盒足够制备150多个10μL包埋块(如果用纯化好的DNA)或25个10μL包埋块(如果用悬浮细胞)。
一、准备试剂
- 在装有2.3g甲基化修饰溶液B成分一干粉的棕色瓶中加入3.9mL水和0.9mL甲基化修饰溶液A，摇晃溶解得到4.8mL溶液B成分一。
- 在装有110mg溶液B成分二干粉的离心管中加入1mL 50℃预热的超纯水，摇晃溶解，得到溶液B成分二。
- 将0.6mL溶液B成分二加入到4.8mL溶液B成分一中，得到5.4mL溶液B工作液，冰上放置待用。未用完的溶液B工作液不得再使用。
- 每次实验前，将装有1.5mL包埋液的离心管在沸水浴上放置数分钟直到变成溶液，然后放80℃待用。
二、对微量组织材料(如果材料足够，可先纯化DNA，再直接进入第三步)
- 用常规的胰酶消化法处理动物实体组织或培养细胞，得到浓度不超过60个细胞/μL的单细胞PBS悬液。如果实验材料已经是单细胞悬浮液(如卵细胞)，则PBS洗涤后直接离心沉淀，再重悬在PBS中(浓度不超过60个细胞/μL)。
注：本试剂盒不含本步所需相关试剂，如胰酶消化液和PBS。 - 在一个自备的2mL离心管中加入3μL上步所得细胞悬液，再迅速滴加7μL在80℃预热的包埋液，共得10μL包埋液-细胞混合液。
注：不需要吹打混匀以免混合液在抢头里面凝固。 - 加入500μL分子生物学级石蜡油确保后续处理过程中溶液不会蒸发。短暂离心确保10μL包埋液-细胞混合液沉到管底。
- 将离心管在沸冰浴中放20分，此步可将DNA分子变性成单链。
- 将离心管转移到冰上放置30分钟，包埋液-细胞混合液将凝固成10μL的包埋块，包埋块中将包含细胞的基因组DNA和蛋白质组份。
- 在包埋块中加入500μL包埋块裂解液和5μL蛋白酶K溶液(10mg/mL)，短暂离心后37℃保温过夜。此步将降解包埋块中的蛋白质组份。
- 吸弃包埋块之外的所有溶液(包括石蜡油)后，分别用1mL TE缓冲液室温浸泡包埋块2次，每次15分钟。此步可去除残留在包埋块中的裂解液和蛋白酶K。
- 酶切包埋块中的基因组DNA：选定不识别PCR靶片段的内切酶(本试剂盒不提供该试剂)，再用此酶对应的100μL 1×酶切缓冲室温液浸泡包埋块15分钟，吸弃该缓冲液后再加入100μL 1×酶切缓冲和50U选的的内切酶，37℃保温2小时后吸弃内切酶反应液。
- 加入500μL新鲜配制的处理液A，室温放置15分钟后吸弃处理液A。
处理液A配制方法：100μL DNA甲基化修饰溶液A +400μL超纯水。 - 重复上步一次。此时DNA将呈单链。
- 加入1mL新鲜配制的处理液B(不是溶液B)，室温浸泡包埋块5分钟后吸弃处理液B。
处理液B配制方法：50μL DNA甲基化修饰溶液A +950μL超纯水。 - 加入750μL石蜡油，然后沸水浴30秒，使DNA变性。
- 将离心管转移到冰上放置30分钟使包埋块重新凝固，单链DNA将固化。
- 在离心管中加入1mL在第3步预冷的溶液B工作液，短暂离心后继续在冰上放置30分钟。此步用于修饰固化的单链DNA。
- 将离心管转移到50℃放置3.5小时后吸弃溶液B工作液。
- 分别用1mL TE缓冲液常温洗涤包埋块2次，每次15分钟，吸弃TE缓冲液。
- 分别用500μL新鲜配制的处理液C(50μL DNA甲基化修饰溶液A + 450μL超纯水)常温洗涤包埋块2次，每次15分钟，然后吸弃处理液C。
- 用1mL TE缓冲液常温洗涤包埋块3次，每次10分钟，然后吸弃TE缓冲液。
- 所得包埋块可以在4℃保存数月待用，也可以用超纯水洗涤两次(每次15分钟)后直接用做100μL体系甲基化PCR的模板。
三、对纯化好的DNA溶液
- 如果样本是纯化好的DNA溶液，先用不识别PCR靶片段的合适内切酶酶切DNA，总体积不超过20μL，DNA不超过700ng。本试剂盒不提供所需内切酶。
- 酶切结束后，沸水浴10分钟灭活内切酶并变性DNA。
- 冰上放置并短暂离心数秒后，再加入4μL DNA甲基化修饰溶液A，50℃保温15分钟。
- 迅速加入50μL在80℃预热的包埋液，用手指快速弹击管底混匀溶液并继续放80℃待用。不要吹打混匀以避免包埋液在移液枪头中凝固。
- 在一个新的2mL离心管中，加入1mL第3步预冷的溶液B工作液，再加上750μL石蜡油，短暂离心后将离心管放冰上预冷。
- 迅速取80℃保温的混合液10μL(第27步)，用在空中滴加的方式加到第28步准备的预冷离心管中，滴加的混合液遇冷将迅速在石蜡油中形成一个包埋块。
注：不要将枪头浸入到预冷的溶液中，否则包埋液将迅速在枪头内凝固。如果包埋块没有沉到管底，可以用枪头将其拨到石蜡层下面的液相中。 - 再重复上步操作6次，共可以得到7个包埋块(每块约含100ng DNA)。
- 将离心管(含7个包埋块)继续放冰上30分钟进行修饰。
- 后续操作同第19～23步。
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